172 | ČESKÁ A SLOVENSKÁ FARMACIE / Čes. slov. Farm. 2024;73(3):169-174 / www.csfarmacie.cz FARMACEUTICKÁ TECHNOLOGIE Nové přístupy k problematice pyrogenů v parenterálních přípravcích než testy na zvířatech, což vede k relevantnějším výsledkům pro humánní použití. Nevýhody MAT: Složitost a náklady: MAT je technicky náročnější a vyžaduje více kroků v laboratorním prostředí než některé jednodušší testy, jako je BET. To může zvýšit náklady na testování a vyžadovat speciálně vyškolený personál. Citlivost na laboratorní podmínky: Výsledky MAT mohou být ovlivněny variabilitou v přípravě a kvalitě buněk, jakož i podmínkami inkubace a manipulace. To může vést k vyššímu riziku falešně pozitivních nebo falešně negativních výsledků, pokud nejsou podmínky přísně kontrolovány. Omezená dostupnost komerčních souprav: Na trhu je méně komerčně dostupných souprav pro MAT ve srovnání s jinými testovacími metodami, což může omezit jeho dostupnost pro některé laboratoře. Regulační uznání: Ačkoli MAT je uznán v některých lékopisech (např. Ph. Eur.), stále může být méně rozšířený nebo preferovaný ve srovnání s tradičními metodami v některých jurisdikcích nebo pro specifické aplikace (9). 2. Detekce zaměřená na endotoxiny a. Bakteriální endotoxinový test (Bacterial endotoxin test – BET) (lékopisný článek 2. 6. 14) Jako první byl pro detekci endotoxinů vyvinut test gelové sraženiny Lyzátu amebocytů kraba rodu Limulus (LAL), následně se objevily další, pokročilejší varianty testu LAL. Lyzát amebocytů je vodný extrakt z pohyblivých krvinek (amebocytů) z ostrorepa atlantského Limulus polyphemus, případně Tachypleus tridentatus. LAL reaguje s bakteriálními endotoxiny, jako jsou lipopolysacharidy (LPS). Tato reakce je základem testu LAL, který je široce používán pro detekci a kvantifikaci bakteriálních endotoxinů. Tyto testy mohou nejen určit přítomnost/nepřítomnost endotoxinu ve vzorku, ale také odhalit, kolik endotoxinu je přítomno. To je zajištěno porovnáním zjištěné hodnoty s referenční hodnotou standardu. Tato kvantitativní data usnadňují shodu s testováním kontroly kvality (QC) a poskytují standardy integrity dat pro širokou škálu aplikací. α. Kvalitativní stanovení endotoxinu – Test gelové sraženiny LAL Je tou nejjednodušší formou testu LAL a nejvíce se podobá původně vyvinuté metodě BET. Jedná se o nečastější test uváděný v lékopisných monografiích. Poskytuje snadno čitelný kvalitativní i kvantitativní výsledek indikující přítomnost nebo nepřítomnost endotoxinu ve zkušebním vzorku. Test gelové sraženiny LAL zahrnuje smíchání činidla LAL s testovaným vzorkem ve zkumavce, která se poté inkubuje. Pokud je ve vzorku přítomen endotoxin, spustí se srážecí reakce. Po uplynutí inkubační doby se zkumavka prohlédne, aby se zjistilo, zda se na dně zkumavky vytvořila sraženina (nebo gel). Pozitivní výsledek je tedy potvrzen přítomností sraženiny, která zůstává na dně zkumavky při jemném převrácení, zatímco negativní výsledek je charakterizován přítomností tekutiny stékající po vnitřní straně zkumavky. Jedná se tedy o limitní zkoušku, jejíž výhodou je jednoduchost a nižší cena. Nevýhodou je neznámé množství endotoxinu, a to jak v případě pozitivního, tak i v negativního výsledku (s výjimkou skutečnosti, že se výsledné množství endotoxinu nachází nad nebo pod stanoveným limitem). β. Kvantitativní stanovení endotoxinu Umožňuje přesné stanovení množství endotoxinu v přípravku a následné další nastavení risk managementu v rámci výroby, zejména s ohledem na možnost nastavení limitů, kontrolních opatření (je možné okamžitě identifikovat a řešit zdroje kontaminace) a efektivního řízení rizik. Chromogenní test Jedná se o metodu optické spektroskopické analýzy, která umožňuje měření přítomnosti analytu (kvalitativní analýza) a jeho koncentrace v různých prostředích (kvantitativní analýza) prostřednictvím změn barev. Turbidimetrická metoda Metoda je založena na spektrofotometrickém měření. Jde tedy o jev, kdy se pevné částice objeví v homogenním roztoku. Přenášené světlo je měřeno v určité vlnové délce, následně se získá hodnota, která je úměrná koncentraci látky (10, 11). Aby byla detekce endotoxinů při využití LAL testu platná, musí být prokázáno, že zkušební ředění nepřekračuje maximální možné ředění a že zkoušené ředění neprokazuje inhibici nebo zesílení expozice při použití známé koncentrace endotoxinu. Maximální platné ředění (MVD) je maximální přípustné ředění vzorku, při kterém lze stanovit limit endotoxinu. LAL test může být poměrně náchylný k interferenci. Obvykle je však test LAL citlivější, než je potřebné k detekci limitu endotoxinů pro daný produkt. Validace postupu vyžaduje, aby byly tři šarže testovány na interferující faktory. Test interferujících faktorů pomocí gelové sraženiny vyžaduje, aby byl produkt validován podle požadavku výrobce pro použitou citlivost testu. Za tímto účelem se vyrábí standardní řada v LAL reagenční vodě (LRW), která obsahuje 2λ, λ, 1/2 λ a 1/4 λ, kde λ představuje citlivost lyzátu. Paralelně se provádí druhá standardní řada stejných koncentrací s použitím přípravku (při neinterferenčním ředění nebo účinném ošetření produktu). Tato standardní řada musí také obsahovat 2λ, λ, 1/2 λ a 1/4 λ v minimálně čtyřnásobném provedení. Kaskáda LAL se skládá z řady enzymatických reakcí. Rychlost reakce ovlivňuje řada faktorů, jako je pH a teplota. Je tedy důležité, aby pH reakční směsi produktu a činidla LAL bylo v požadovaném rozmezí. Dvojmocné kationty, jako je vápník (Ca2+) a hořčík (Mg2+), neutralizují záporný náboj endotoxinu, to následně zvyšuje agregaci a tím snižuje aktivitu/účinnost endotoxinu, což vede k inhibici reakce. To má za následek falešně negativní výsledky. Obvyklým řešením tohoto problému je vhodné naředění, případně lze endotoxin od interferujících látek oddělit ultrafiltrací pomocí asymetrického membránového filtru z celuloso-triacetátu (12). Látky, které vážou (chelátotvorné) dvojmocné kationty, jako je EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová) a heparin, mohou snížit stav agregace endotoxinu. To má za následek zvýšenou reaktivitu v průběhu testu
RkJQdWJsaXNoZXIy NDA4Mjc=